唐奕教授本科畢業(yè)于賓夕法尼亞州立大學(xué)，在David A. Tirrell教授完成博士，在Chaitan Khosla教授的指導(dǎo)下完成了博士后的工作，他的研究方向主要集中在天然產(chǎn)物生物合成和生物催化領(lǐng)域。曾獲美國(guó)總統(tǒng)獎(jiǎng)、美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)Author C. Cope 獎(jiǎng)等多項(xiàng)殊榮。C-H鍵是有機(jī)分子中最常見(jiàn)的化學(xué)鍵，因此C-H鍵在化學(xué)合成中處于非常重要的地位。C-H鍵轉(zhuǎn)化反應(yīng)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是如何選擇性對(duì)特定C(sp3)-H化學(xué)鍵進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在這些年，人們發(fā)現(xiàn)金屬酶能夠催化C(sp3)-H化學(xué)鍵的官能團(tuán)化。雖然近些年得到顯著的發(fā)展和進(jìn)步，但是對(duì)惰性C(sp3)-H鍵的酶催化鹵化反應(yīng)仍然只能通過(guò)非血紅素Fe/α-酮戊二酸依賴性鹵化酶（α-ketoglutarate-dependent halogenase），因此導(dǎo)致化學(xué)可及性受到局限。 有鑒于此，加州大學(xué)洛杉磯分校唐奕教授、Masao Ohashi教授等報(bào)道在含有未知功能結(jié)構(gòu)域3328（DUF3328）的蛋白質(zhì)家族中，發(fā)現(xiàn)了一種未曾發(fā)現(xiàn)的鹵化酶ApnU，并進(jìn)行表征。ApnU在活性中心位點(diǎn)使用Cu作為催化劑，對(duì)多個(gè)惰性C(sp3)-H鍵進(jìn)行迭代催化氯化。通過(guò)Cu金屬中心具有的較軟特點(diǎn)，ApnU展現(xiàn)了出乎預(yù)料的酶催化C(sp3)-H官能團(tuán)化性能，包括碘化（iodination）和硫氰化（thiocyanation）。通過(guò)生化特征和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了ApnU的低聚功能態(tài)（oligomeric state），這種低聚態(tài)呈現(xiàn)了共價(jià)連接的二聚體，其中含有由雙硫鍵形成的三個(gè)基本結(jié)構(gòu)，一對(duì)是鏈間雙硫鍵，兩對(duì)鏈內(nèi)雙硫鍵。通過(guò)ESR表征，驗(yàn)證ApnU含有的金屬配位活性位點(diǎn)含有雙核II型Cu中心位點(diǎn)。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)拓展了鹵酶催化C(sp3)-H鹵化反應(yīng)的能力，為雙核Cu依賴性氧化酶的提供基礎(chǔ)性的理解。酶的功能未知3328(DUF3328)域在真菌天然產(chǎn)物生物合成途徑中廣泛的存在，根據(jù)其基因特點(diǎn)，其包括C(sp3)-H氧化官能團(tuán)化，包括成環(huán)、去飽和、羥基化、氯化。ApnU是這種酶家族的一種，比如atpenin B (1), atpenin A4 (2), atpenin A5 (3)（圖1c）。首先，通過(guò)基因失活（ genetic inactivation）驗(yàn)證了ApnU在氯化反應(yīng)中由1轉(zhuǎn)化為2和3的情況，發(fā)現(xiàn)敲除apnU之后，2和3消除，但是1逐漸累積；隨后，補(bǔ)充apnU之后，恢復(fù)了生成2和3的活性。 通過(guò)分析序列和結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ApnU含有兩個(gè)HXXHC結(jié)構(gòu)，四個(gè)His側(cè)鏈能夠形成平面的四個(gè)角（約5.4?×6.1?），兩個(gè)半胱氨酸殘基位于平面下方（圖1d）。ApnU的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明其含有49個(gè)殘基（編號(hào)31-79）的N-終端跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（N-terminal transmembrane helix）（圖1d）。將75 N終端殘基替換為可溶的標(biāo)簽（10個(gè)氨基酸序列：MAKKTSSKGK），得到部分可溶的蛋白并進(jìn)行提純。將純化的蛋白與1、康壞血酸、NaCl一起進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)1轉(zhuǎn)化為單氯化2主要產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率較低（10 %），生成二氯化產(chǎn)物3次要產(chǎn)物。向反應(yīng)中加入EDTA后反應(yīng)活性消失，表明酶催化活性具有金屬依賴性。在優(yōu)化的條件下，能夠從包涵體中重新折疊蛋白質(zhì)，獲得可溶的ApuU。將重新折疊的apo-ApnU與1、抗壞血酸、各種過(guò)渡金屬（Mn(II), Fe(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II)）進(jìn)行培養(yǎng)，LC-MS表征結(jié)果表明，只有在Cu(II)存在時(shí)，1具有氯化反應(yīng)活性，50 %的1轉(zhuǎn)化為氯化產(chǎn)物3和4。其中，4的質(zhì)譜為m/z=400，對(duì)應(yīng)于三氯化產(chǎn)物。此外發(fā)現(xiàn)少量5產(chǎn)物（m/z=296），對(duì)應(yīng)于1的脫氫產(chǎn)物。放大量反應(yīng)并且分離4和5，進(jìn)行NMR表征。NMR表征結(jié)果表明4號(hào)分子的第三個(gè)氯位于3的C5′位點(diǎn)，得到偕二氯的四級(jí)碳原子。總之，以上研究結(jié)果表明ApnU是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)能夠迭代C(sp3)-H氯化的Cu依賴性鹵化酶。 與大多數(shù)Cu金屬酶相似，ApnU通過(guò)O2作為氧化劑活化C-H鍵，在無(wú)氧條件下ApnU沒(méi)有表現(xiàn)催化活性（圖2c）。抗壞血酸作為必不可少的還原劑，其他的還原劑（比如DTT(二硫蘇糖醇)和Na2S2O4）無(wú)法用于氯化反應(yīng)（圖2d）。在pH 6.0 MES緩沖液中，ApnU獲得最好的氯化反應(yīng)活性。當(dāng)NaCl濃度增加，氯化程度（3 vs 4）增加，在濃度為50 mM NaCl時(shí)得到最大的氯化反應(yīng)數(shù)目。在沒(méi)有氯化物的情況，整體催化活性明顯降低，表明氯化物與Cu中心之間的配位對(duì)于C(sp3)-H鍵活化非常重要。ApnU催化新型C(sp3)-H鍵官能團(tuán)化 由于ApnU使用的是軟金屬Cu用于鹵化反應(yīng)，因此作者認(rèn)為ApnU能夠與Fe依賴性NHFeHal起到不同的鹵化物/準(zhǔn)鹵化物進(jìn)行反應(yīng)。因此，將不含氯的ApnU與1以及不同的陰離子進(jìn)行活性測(cè)試，結(jié)果表明能夠與Br-、N3-、NO2-生成官能團(tuán)化的加合物（與Fe依賴性NHFeHal類似）。此外，柔性更高的陰離子（I-、SCN-、SeCN-）同樣能夠反應(yīng)（Fe依賴性NHFeHAl不具有這種催化活性）。在這些陰離子濃度更高的情況下，反應(yīng)只能生成單取代的產(chǎn)物，而且沒(méi)有副產(chǎn)物生成。放大量實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝铣刹⒎蛛x碘化物、硫氰酸鹽產(chǎn)物、硒氰酸鹽產(chǎn)物（6-8）。通過(guò)NMR分析發(fā)現(xiàn)反應(yīng)的區(qū)域選擇性是C5′（圖2e）。當(dāng)使用F-、CN-、OCN-、HCOO-、NO3-、CH3S-，未見(jiàn)產(chǎn)物生成（圖2e）。ApnU的獨(dú)特Cu活性位點(diǎn)使得ApnU實(shí)現(xiàn)了區(qū)域選擇性的C(sp3)-H官能團(tuán)化轉(zhuǎn)化。這種非Fe依賴性鹵化酶拓展了酶催化C(sp3)-H鍵官能團(tuán)化的種類。圖3. 表征ApnU發(fā)現(xiàn)二硫鍵交聯(lián)的二聚體在重新折疊形成ApnU的過(guò)程中，需要加入GSH/GSSG，當(dāng)GSH和GSSG的量相同，折疊的效果最好。當(dāng)不加入GSH/GSSG，雖然能夠獲得可溶的蛋白，但是得到的蛋白完全沒(méi)有催化活性。這個(gè)結(jié)果表明ApnU的六個(gè)半胱氨酸進(jìn)行正確重構(gòu)是蛋白質(zhì)折疊的關(guān)鍵。 使用陰離子交換色譜、尺寸排阻色譜表征，發(fā)現(xiàn)重新折疊的ApnU具有兩個(gè)主要物種（I和II），質(zhì)量為30 kDa（圖3a）。分別分離并提純，發(fā)現(xiàn)只有I具有氯化酶的催化活性，II沒(méi)有氯化酶的催化活性。通過(guò)LC-QTOF-MS表征變性蛋白的質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)分子量為59,056 Da，對(duì)應(yīng)于ApnU的二聚體，并且對(duì)應(yīng)于由于生成二硫化學(xué)鍵導(dǎo)致減少12-Da（圖3b）。通過(guò)天然蛋白質(zhì)的質(zhì)量分析，進(jìn)一步證實(shí)了ApnU的二聚體狀態(tài)。圖4. ApnU的EPR表征以及提出鹵化機(jī)理對(duì)HXXHC的四個(gè)his進(jìn)行突變，驗(yàn)證四個(gè)his對(duì)于ApnU的活性都是必須的，這可能是因?yàn)槠銫u結(jié)合的作用。通過(guò)ICP-MS表征His6-tag-free ApnU，發(fā)現(xiàn)每個(gè)ApnU的金屬最大結(jié)合數(shù)目為2.3±0.1。通過(guò)EPR表征His6-tag-free ApnU的Cu中心位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。當(dāng)加入過(guò)量的Cu(II)，并且通過(guò)脫鹽或者透析處理干凈樣品，含有Cu(II)的ApnU的EPR譜結(jié)果表明type II型Cu(II)信號(hào)，每個(gè)活性位點(diǎn)具有接近2個(gè)Cu原子自旋（圖4a）。加入過(guò)量抗壞血酸或者在無(wú)氧條件測(cè)試，發(fā)現(xiàn)Cu(II) EPR信號(hào)消失，驗(yàn)證了抗壞血酸將Cu(II)還原為Cu(I)啟動(dòng)催化反應(yīng)。 模擬EPR譜的結(jié)果表明兩個(gè)有所區(qū)別的Cu(II)信號(hào)g值和超精細(xì)耦合常數(shù)Az(Cu)（圖4a），表明每個(gè)Cu(II)處于N/O混合配位環(huán)境和平面四方形結(jié)構(gòu)。觀測(cè)的g≈2.05的信號(hào)超精細(xì)裂分結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)應(yīng)該是14N與Cu(II)之間的超精細(xì)相互作用，這個(gè)結(jié)果支持了Cu結(jié)合位點(diǎn)。光譜表征結(jié)果表明，靜息態(tài)的兩個(gè)Cu沒(méi)有磁耦合，表明兩個(gè)Cu(II)原子的間距超過(guò)6 ?。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及已知的雙核Cu酶催化機(jī)理，DFT理論計(jì)算，提出了ApnU的可能鹵化反應(yīng)機(jī)理（圖4b）。靜息態(tài)含有兩個(gè)沒(méi)有耦合的Cu(II)中心，隨后通過(guò)抗壞血酸還原為Cu(I)，隨后O2活化生成過(guò)氧橋連雙核INT1(μ-η2:η2-peroxo)Cu(II)Cu(II)。Cu中心與陰離子配位，形成INT2，通過(guò)抗壞血酸發(fā)生摘?dú)湓臃磻?yīng)生成INT3(μ‐O·)(μ‐OH)Cu(II)Cu(II)。INT3是反應(yīng)活性物種，能夠從反應(yīng)物1摘?dú)洌?jì)算結(jié)果表明該步驟的能壘為4.4 kcal mol-1，通過(guò)該步驟生成鹵化產(chǎn)物，同時(shí)消耗一個(gè)Cu(II)位點(diǎn)。隨后另一個(gè)Cu(II)與抗壞血酸反應(yīng)重新開(kāi)始催化反應(yīng)。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了從前未知的ApnU（從屬于真菌蛋白的DUF3328家族），并且進(jìn)行生化分析表征。ApnU是Cu依賴性催化劑，能夠?qū)Χ鄠€(gè)C(sp3)-H鍵進(jìn)行迭代的氯化，ApnU含有保守的雙HXXHC結(jié)構(gòu)（其他DUF3328蛋白同樣存在），通過(guò)EPR和ICP-MS表征驗(yàn)證與兩個(gè)Cu(II)金屬離子結(jié)合。ApnU的Cu中心具有超預(yù)料的C(sp3)-H官能團(tuán)化性能，這些催化活性與Fe的鹵化酶不具備的。雖然人們發(fā)現(xiàn)黃素依賴性鹵化酶能夠進(jìn)行區(qū)域選擇性C(sp3)-H碘化，但是ApnU能夠進(jìn)行位點(diǎn)選擇性的C(sp3)-H碘化反應(yīng)、硫氰酸化反應(yīng)、硒氰酸化反應(yīng)。Fe依賴性酶雖然具有優(yōu)秀的催化活性，而且容易進(jìn)行進(jìn)化，但是Cu依賴性酶仍然展現(xiàn)了對(duì)酶催化C(sp3)-H鍵官能團(tuán)化反應(yīng)種類的拓展。這項(xiàng)工作為研究目前未曾關(guān)注的DUF3328金屬酶家族提供廣闊的機(jī)會(huì)，有助于開(kāi)發(fā)新型酶功能。 Chiang, CY., Ohashi, M., Le, J. et al. Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C?H bond functionalization. Nature (2025).DOI: 10.1038/s41586-024-08362-4https://www.nature.com/articles/s41586-024-08362-4
