血紅素過氧化物酶（Haem peroxygenases）能夠使用H2O2向有機(jī)分子中修飾氧原子，是受到廣泛關(guān)注的生物催化劑。但是血紅素過氧化酶的應(yīng)用受制于使用外源性H2O2導(dǎo)致不可逆的氧化失活。有鑒于此，廈門大學(xué)王斌舉教授、湖北大學(xué)李愛濤教授等報(bào)道血紅素過氧化物酶的一種新型催化反應(yīng)，這種新型催化反應(yīng)使用O2和小分子還原劑（抗壞血酸、脫氫抗壞血酸（DHA））實(shí)現(xiàn)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算的結(jié)果表明DHAA（脫氫抗壞血酸DHA的水化物分子）是關(guān)鍵的共反應(yīng)物分子，用于活化O2分子產(chǎn)生催化活性的鐵氧（oxyferryl）血紅素化合物I。此外，這項(xiàng)研究展示了這種O2/還原劑依賴性反應(yīng)能夠用于多種多樣的血紅素過氧化酶，展示了這種生物催化方法是重要的單氧酶功能。這種策略避免使用H2O2，因此避免了酶的不可逆失活問題。最后，反應(yīng)能夠以優(yōu)異的產(chǎn)量大量的合成手性、高附加值產(chǎn)物，揭示了這種過氧化酶策略在可持續(xù)化學(xué)轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用前景。圖1. 血紅素氧化酶的各種催化反應(yīng)生成鐵氧(oxyferryl)血紅素化合物I（CpdI）
在各種血紅素過氧化酶中，非特異性過氧化酶（UPO）能夠使用H2O2作為氧化劑，向含有惰性C-H化學(xué)鍵的有機(jī)化學(xué)物引入氧原子（圖1a）。除了UPOs之外，一些細(xì)胞色素P450s（比如CYP152過氧化酶，OleTJE、P450SPα、P450BSβ）同樣是H2O2依賴性過氧化酶（圖1a）。此外，除了經(jīng)典P450單氧化酶需要使用氧化還原配合物以及還原劑（DAD(P)H）活化O2分子（圖1b），UPOs和P450過氧化酶具有更簡單的結(jié)構(gòu)，能夠與H2O2直接生成活性鐵氧血紅素化合物I（CpdI），避免了復(fù)雜的電子轉(zhuǎn)移鏈（圖1d）。雖然UPOs和P450過氧化酶是具有選擇性的氧官能團(tuán)化催化劑，催化反應(yīng)需要加入外源性H2O2，這導(dǎo)致酶催化劑的不可逆氧化失活。這個(gè)問題嚴(yán)重限制了其在選擇性氧官能團(tuán)化的工業(yè)應(yīng)用。圖2. 體系含有小分子還原劑的rAaeUPO催化1a羥基化反應(yīng)為了研究UPOs是否能夠利用O2作為氧化反應(yīng)的氧化劑，研究了一種研究非常廣泛的rAaeUPO，以乙基苯（1a）的羥基化反應(yīng)作為模型反應(yīng)。向反應(yīng)體系加入不同小分子還原劑（圖2a,b）。測試結(jié)果表明，只有當(dāng)反應(yīng)體系同時(shí)具有rAaeUPO、反應(yīng)物、AscA，能夠生成(R)-1-苯乙醇（1b）（圖2c）。為了進(jìn)一步研究反應(yīng)是否是O2依賴性，對無氧、有氧體系的反應(yīng)情況都進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明反應(yīng)在有氧條件下具有非常好的反應(yīng)活性，但是在無氧條件下的反應(yīng)活性非常低（圖2d）。這個(gè)現(xiàn)象表明rAaeUPO的催化氧化反應(yīng)是AscA和O2都具有依賴性。此外，通過18O2同位素標(biāo)記驗(yàn)證了氧化產(chǎn)物中的氧原子來自18O2（圖2e）。最后，測試了rAaeUPO酶催化劑，以1a作為反應(yīng)物，在AscA存在情況的催化反應(yīng)，反應(yīng)生成了60 mM的產(chǎn)物，反應(yīng)的TON達(dá)到632,100?±?37,073（圖2f）。UPO催化反應(yīng)的共同反應(yīng)物圖3. 鑒定rAaeUPO催化反應(yīng)中的真實(shí)反應(yīng)物DHA人們研究發(fā)現(xiàn)，在溶液相中，AscA能夠氧化生成DHA，隨后水解生成2,3-二酮-L-古洛糖酸（DKG）。此外，DHA在水中主要以水化形式存在（圖3a）。作者認(rèn)為DHA或者水化DHAA或者DKG有可能是反應(yīng)中的真實(shí)氧化劑。因此，分別使用AscA、DHA、DKG作為還原劑，分別測試rAaeUPO催化反應(yīng)的催化反應(yīng)活性（起始反應(yīng)速率）。測試結(jié)果表明，當(dāng)體系加入DHA還原劑，起始反應(yīng)速率達(dá)到144 min-1，起始反應(yīng)速率比AscA快58 %。當(dāng)體系加入的還原劑是DKG，反應(yīng)沒有產(chǎn)生生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DHA（或DHAA）可能是UPO催化反應(yīng)的真正還原劑（圖3b）。之后，分別在有氧和無氧條件測試反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只有在有氧條件下實(shí)現(xiàn)顯著的催化活性，這個(gè)結(jié)果表明反應(yīng)的發(fā)生同時(shí)需要DHA和O2。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了DHA在UPO催化反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，當(dāng)使用還原性更強(qiáng)的DTT時(shí)，加入10 mM DTT導(dǎo)致反應(yīng)完全無法發(fā)生（圖3d）。當(dāng)使用DHA作為還原劑，加入DTT導(dǎo)致酶催化活性明顯降低（圖3e），這是因?yàn)镈TT影響了DHA恢復(fù)到AscA。以上結(jié)果驗(yàn)證了DHA（或者DHAA）在反應(yīng)中起到真正的還原劑，而不是AscA。隨后，研究DHA的消耗與rAaeUPO的依賴性關(guān)系。研究結(jié)果表明，當(dāng)rAaeUPO存在時(shí)，DHA的反應(yīng)速率提高6倍（圖3f）。對比的結(jié)果表明，AscA的消耗速率明顯低于DHA（圖3f）。研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，催化反應(yīng)與外源性H2O2不相關(guān)（圖3g）。圖4. DHAA存在下UPO活化O2的機(jī)理理論計(jì)算研究。通過理論計(jì)算研究UPOs在DHA還原劑存在的催化反應(yīng)機(jī)理。如圖4a所示，反應(yīng)物可能是水化的縮醛DHA、DHAA。DFT理論計(jì)算結(jié)果表明水化DHA生成DHAA是放熱過程，表明DHA能夠以水化形式在溶液相存在。如圖4b所示，通過分子動力學(xué)模擬計(jì)算，發(fā)現(xiàn)DHAA能夠穩(wěn)定的結(jié)合在UPO的活性位點(diǎn)，但是DHAA通過E196、R189、T192之間具有氫鍵相互作用。這個(gè)結(jié)果表明，DHAA是UPO催化反應(yīng)的還原劑。并且計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。圖5. 驗(yàn)證rAaeUPO催化反應(yīng)中，GA和PA分子是共同反應(yīng)物除了在新鮮植物組織中發(fā)現(xiàn)的DHA和AscA，本研究認(rèn)為木質(zhì)素組織中豐富的多酚化合物能夠作為UPO催化氧化反應(yīng)的還原劑。因此，在rAaeUPO催化1a羥基化反應(yīng)中分別加入GA或PA，測試催化反應(yīng)（圖5a）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GA和PA都能夠作為共同反應(yīng)物，表現(xiàn)優(yōu)異的催化活性，起始反應(yīng)速率分別達(dá)到265 min-1和141 min-1（圖5b）。這個(gè)性能甚至超過了DHA作為共同反應(yīng)物的催化反應(yīng)速率。當(dāng)加入U(xiǎn)PO酶，顯著加快GA和PA的消耗速率（圖5c）。這些結(jié)果表明GA和PA是UPO催化氧化反應(yīng)的還原劑。理論計(jì)算研究。通過理論計(jì)算研究多酚還原劑在UPO酶催化氧化活化O2機(jī)理。使用GA作為還原劑，發(fā)現(xiàn)GA與DHAA非常類似，O2與GA摘取的氫之間耦合，生成·OOH自由基并且與Fe(III)配位（圖5d）（中間體2IM1′）。然后，GA自由基的OH官能團(tuán)與·OOH形成氫鍵相互作用，產(chǎn)生更加穩(wěn)定的中間體2IM2′。研究發(fā)現(xiàn)·OOH自由基容易與相鄰酚自由基的OH官能團(tuán)發(fā)生摘?dú)湓臃磻?yīng)，生成Fe(III)-H2O2中間體。圖6. UPO-過氧化酶和P450-過氧化酶分別使用不同還原劑的催化反應(yīng)性能分別測試了AscA、DHA、GA、PA作為還原劑，各種血紅素過氧化酶的O2/還原劑依賴性反應(yīng)。結(jié)果表明，MroUPO（環(huán)己烷羥基酶，Marasmius rotula來源）、CfuCPO（苯甲硫醚的磺氧化酶，Caldariomyces fumago來源）、P450過氧化酶（月桂酸氧化酶，分別為P450SPα（Sphingomonas paucimobilis來源）、P450BSβ（Bacillus subtilis來源）、OleTJE（Jeotgalicoccussp. ATCC 8456來源）五種代表性的過氧化酶在加入還原劑之后，都表現(xiàn)更高的催化活性（圖6a,b）。對于CfuCPO（對H2O2的容忍性更高），只有DHA和GA兩種還原劑能夠比H2O2-催化活性更強(qiáng)（圖6c）。P450SPα和P450BSβ對月桂酸的羥基化反應(yīng)中，各種還原劑都表現(xiàn)比H2O2-催化活性更高（圖6c,e）。特別是，以GA和PA作為還原劑，實(shí)現(xiàn)了100 %的轉(zhuǎn)化。在P450OleTJE催化的脫羧反應(yīng)，加入還原劑后表現(xiàn)比H2O2-催化活性更好的效果（圖6f）。這些研究結(jié)果表明，血紅素過氧化酶的O2/還原劑依賴性催化反應(yīng)具有廣泛的兼容性，展示了優(yōu)異的催化活性。比較O2/還原劑依賴性催化反應(yīng)和H2O2-依賴性催化反應(yīng)圖7. 比較O2/還原劑-依賴性、H2O2-依賴性rAaeUPO催化體系為了進(jìn)一步研究O2/還原劑依賴性比傳統(tǒng)H2O2-依賴性路線的優(yōu)勢，通過光譜表征研究不同濃度的H2O2或者AscA的反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)rAaeUPO加入外源性H2O2，UV-Vis光譜表征的Soret峰（ferric Fe的停留態(tài)）強(qiáng)度逐漸降低，并且產(chǎn)生氣泡。相比的UPO/DHAA/O2體系，生成單一Fe(III)-H2O2中間體，避免了H2O2的結(jié)合和反應(yīng)。因此，UPO/DHAA/O2體系的反應(yīng)能夠非常好的控制Cpd I的生成以及反應(yīng)物氧化，避免了血紅素鐵的損壞，避免酶的失活。此外，由于H2O2具有強(qiáng)氧化性，因此使用外源性H2O2的體系無法應(yīng)用于容易H2O2氧化的反應(yīng)物（圖7）。研究結(jié)果表明，O2/(AscA/DHA)-依賴性催化反應(yīng)能夠避免使用外源性H2O2，因此適用于容易被H2O2氧化的反應(yīng)物。圖8. 使用AscA作為還原劑的大量反應(yīng)合成高附加值產(chǎn)物為了展示O2/還原劑依賴性過氧化酶催化體系的工業(yè)應(yīng)用前景，通過放大實(shí)驗(yàn)，加入還原劑制備高附加值產(chǎn)品（圖8）。從兩個(gè)反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，分別是rAaeUPO催化芐基羥基化（1a）制備(R)-1-苯乙醇（1b）、P450SPα催化4a羥基化制備α-羥基月桂酸（4b）。使用價(jià)格便宜且容易得到的AscA作為還原劑。測試rAaeUPO催化1a的羥基化反應(yīng)，當(dāng)200 mM 1a、40 g AscA、0.25 μM rAaeUPO的反應(yīng)，能夠生成9.9 g L-1的對映純1b（(R)-1-苯乙醇）和1.8 g L-1的苯乙酮（1c），該反應(yīng)的TON達(dá)到395,600，比H2O2-依賴性反應(yīng)的性能（5 g L-1）更好。測試P450SPα催化4a的α-羥基化反應(yīng)，當(dāng)使用10 g4a，30 g AscA，1.5 μM P450SPα，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到>99 %，生成11.82 g α-羥基化月桂酸（4b），分離產(chǎn)率達(dá)到91 %，TON達(dá)到43,760，這個(gè)結(jié)果比以往報(bào)道的結(jié)果高6倍。這些放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用還原劑的過氧化酶催化反應(yīng)體系在制備高附加值化合物中的應(yīng)用前景。這項(xiàng)研究展示了O2/還原劑-依賴性血紅素過氧化酶催化體系的高效催化性能。在這種酶催化反應(yīng)過程中，新鮮植物組織還原劑（DHA、AscA）或者木質(zhì)素組織常見的多酚化合物還原劑（GA、PA）能夠作為共同反應(yīng)物用于催化氧化反應(yīng)。對于AscA或者DHA作為還原劑的UPOs酶催化反應(yīng)，通過實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算研究表明DHAA是真正活化O2分子還原劑，產(chǎn)生鐵氧血紅素（Cpd I）。在這個(gè)反應(yīng)過程中，在UPO的結(jié)合口袋內(nèi)通過催化反應(yīng)生成Fe(III)-H2O2中間體，這個(gè)過程避免過量H2O2，因此緩解血紅素催化位點(diǎn)的損害，避免酶的失活。使用GA和PA作為還原劑的情況與DHA和AscA不同，GA或PA還原劑在緩沖溶液產(chǎn)生過量H2O2（酶催化口袋外部），這在一定程度上阻礙了酶催化活性。作者發(fā)現(xiàn)O2/還原劑-依賴性酶催化反應(yīng)過程能夠用于其他血紅素過氧化酶催化過程（包括UPO、CPO、CYP152）。此外，本文研究發(fā)現(xiàn)，AscA/DHA還原劑的體系對于容易被H2O2氧化的反應(yīng)物展示了高效率和選擇性氧化。總之，這些研究結(jié)果表明血紅素過氧化酶能夠作為單氧化酶進(jìn)行催化反應(yīng)，取決于環(huán)境的O2以及外部供電子體（或小分子還原劑）。這種O2-依賴性催化反應(yīng)對未來的生物催化體系的發(fā)展提供啟示，而且在脂肪酸的生理代謝、木質(zhì)素降解、植物被致病菌感染等過程中起到作用。最后，這項(xiàng)研究通過擴(kuò)大反應(yīng)體系的量（rAaeUPO催化乙基苯的羥基化、P450SPα催化月桂酸的α-羥基化）展示了這種O2依賴性酶催化反應(yīng)的實(shí)用前景。這項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn)了優(yōu)異的(R)-1-苯乙醇、α-羥基月桂酸產(chǎn)量（產(chǎn)物的量達(dá)到或超過10 g L-1）。這些產(chǎn)物是食品貧、化妝品、制藥領(lǐng)域極為常見。進(jìn)一步，本研究將關(guān)注于推動這些先進(jìn)技術(shù)用于工業(yè)量級制備更多高附加值產(chǎn)品。通過先進(jìn)的突變技術(shù)進(jìn)化技術(shù)增強(qiáng)反應(yīng)的立體選擇性，有助于進(jìn)一步提高這種催化氧化體系的功能。Deng, D., Jiang, Z., Kang, L.et al. An efficient catalytic route in haem peroxygenases mediated by O2/small-molecule reductant pairs for sustainable applications. Nat Catal 8, 20–32 (2025).
DOI: 10.1038/s41929-024-01281-7https://www.nature.com/articles/s41929-024-01281-7
