細(xì)胞焦亡是一種由gasdermin (GSDM) 介導(dǎo)的程序性炎癥細(xì)胞死亡。它通過(guò)在質(zhì)膜上形成孔隙并觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的分泌來(lái)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，為癌癥免疫治療帶來(lái)希望。已報(bào)道了許多誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的藥物，包括離子、小分子治療藥物和納米材料，突顯了它們激活癌細(xì)胞焦亡的潛力。然而，這些藥物中的大多數(shù)對(duì)癌細(xì)胞缺乏選擇性，可能在正常組織中誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致全身毒性。最近，光動(dòng)力療法已成為誘導(dǎo)癌細(xì)胞焦亡的一種特定方法。這種光子控制的細(xì)胞焦亡有可能克服與傳統(tǒng)細(xì)胞焦亡誘導(dǎo)劑相關(guān)的副作用和耐藥性。盡管如此，由于光在生物組織中的穿透深度有限以及腫瘤微環(huán)境的缺氧性質(zhì)，對(duì)光照射和氧氣的需求限制了對(duì)深層腫瘤及其轉(zhuǎn)移的療效。迫切需要一種有效的焦亡誘導(dǎo)劑，它不需要光和氧氣，并選擇性地誘導(dǎo)焦亡殺死深層腫瘤和轉(zhuǎn)移。
超分子相互作用參與了許多調(diào)節(jié)生命所必需的細(xì)胞功能的關(guān)鍵生物過(guò)。在活細(xì)胞內(nèi)直接合成超分子已成為控制細(xì)胞功能和操縱細(xì)胞命運(yùn)的通用策略。具體而言，合成的小分子化合物在癌細(xì)胞溶酶體內(nèi)受控自組裝成超分子結(jié)構(gòu)已被證明可有效治療癌。通過(guò)引起不可逆的溶酶體膜通透性 (LMP)，溶酶體內(nèi)的超分子結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)溶酶體功能障礙和溶酶體細(xì)胞死亡，使其能夠有效克服交叉耐藥性。據(jù)報(bào)道，各種能夠組裝成超分子結(jié)構(gòu)的小分子化合物作為 LMP 誘導(dǎo)劑，大多由兩親性肽結(jié)構(gòu)組成，其序列源自天然蛋白。由于溶酶體含有負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)降解和清除的各種蛋白酶，肽組裝體易被溶酶體蛋白酶水解。這可能會(huì)降低它們?cè)谌苊阁w中的穩(wěn)定性并損害其治療癌癥的功效。此外，這些肽組裝體主要通過(guò)凋亡相關(guān)途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，而凋亡途徑通常會(huì)抑制炎癥，導(dǎo)致對(duì)“冷”腫瘤的免疫反應(yīng)較弱?？刂迫苊阁w合成具有高穩(wěn)定性和效力的超分子結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)選擇性癌細(xì)胞焦亡，隨后引發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，這是一個(gè)持續(xù)的挑戰(zhàn)。
成果簡(jiǎn)介
近日，南京大學(xué)的葉德舉團(tuán)隊(duì)介紹了一種新型腫瘤特異性納米顆粒（NP-NH-D5），該顆粒能夠通過(guò)破壞溶酶體來(lái)激活細(xì)胞焦亡，為癌癥免疫治療提供了新的思路。NP-NH-D5能夠在腫瘤細(xì)胞溶酶體中發(fā)生負(fù)電荷到正電荷的轉(zhuǎn)變，并從納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米纖維，這一過(guò)程通過(guò)響應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和細(xì)胞內(nèi)還原劑（如谷胱甘肽GSH）實(shí)現(xiàn)。形成的非肽納米纖維能夠高效破壞溶酶體，觸發(fā)Gasdermin-D（GSDMD）介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），并改善免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，NP-NH-D5能夠有效抑制原位4T1乳腺腫瘤的生長(zhǎng)，防止轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并延長(zhǎng)生存期，且無(wú)系統(tǒng)性副作用。此外，它還能顯著增強(qiáng)PD-L1抗體免疫治療的效果，尤其在4T1晚期肺轉(zhuǎn)移和侵襲性原位Pan02胰腺腫瘤模型中表現(xiàn)出色。
圖 1 | NP-NH-D5誘導(dǎo)焦亡和抗腫瘤免疫反應(yīng)的示意圖
F-C6-NH2的設(shè)計(jì)、合成及其自組裝為納米纖維
研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種非肽類(lèi)小分子兩親化合物F-C6-NH2，其核心設(shè)計(jì)目標(biāo)是能夠在細(xì)胞內(nèi)自組裝成剛性納米纖維（NFs）。F-C6-NH2由四個(gè)關(guān)鍵部分組成：疏水的3,5-二（三氟甲基）苯基、C6烷基鏈、氨基氧雜熒光素（AO-Luc）熒光團(tuán)和帶有伯胺基團(tuán)的聚乙二醇（PEG3）連接鏈。其中，3,5-二（三氟甲基）苯基提供了強(qiáng)大的分子間疏水相互作用和氫鍵潛力，增強(qiáng)了F-C6-NH2的自組裝穩(wěn)定性和整體穩(wěn)定性；C6烷基鏈對(duì)內(nèi)源性還原劑（如GSH）具有抵抗力，確保了分子在生物環(huán)境中的穩(wěn)定性；AO-Luc熒光團(tuán)不僅通過(guò)π-π堆疊和范德華力促進(jìn)自組裝，還能發(fā)出綠色熒光，便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)F-C6-NH2的動(dòng)態(tài)變化；PEG3連接鏈則平衡了分子的親水性，伯胺基團(tuán)有助于氫鍵的形成和溶酶體內(nèi)的積累。
實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)-C6-NH2在PBS緩沖液中表現(xiàn)出良好的自組裝能力，其臨界組裝濃度約為9.3μM。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)F-C6-NH2能夠快速形成小球形納米顆粒和短納米纖維，并逐漸生長(zhǎng)為平均直徑約12nm的長(zhǎng)納米纖維。原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)一步確認(rèn)了納米纖維的形成，其平均高度約為3nm，且具有較高的楊氏模量（平均值為464±75MPa），表明納米纖維具有較高的剛性。此外，F(xiàn)-C6-NH2的自組裝過(guò)程還通過(guò)圓二色光譜（CD）得到了驗(yàn)證，顯示出典型的β-折疊結(jié)構(gòu)特征。
圖 2 | F-C6-NH2自組裝成納米纖維的表征
F-C6-NH2自組裝成納米纖維并誘導(dǎo)GSDMD介導(dǎo)的焦亡
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)-C6-NH2能夠進(jìn)入HeLa或4T1細(xì)胞，并主要在溶酶體中積累。隨著時(shí)間推移，溶酶體的熒光信號(hào)逐漸消失，而F-C6-NH2的熒光信號(hào)保持明亮，表明溶酶體膜已被破壞。通過(guò)生物透射電子顯微鏡（Bio-TEM）分析，研究團(tuán)隊(duì)觀察到F-C6-NH2處理的HeLa細(xì)胞溶酶體中出現(xiàn)了密集的納米纖維，溶酶體膜顯示出明顯的破裂跡象。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，納米纖維進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹和嚴(yán)重的溶酶體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
此外，F-C6-NH2在HeLa和4T1細(xì)胞中表現(xiàn)出濃度依賴性的細(xì)胞毒性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為2.40±0.14μM和4.05±0.12μM。相比之下，其他對(duì)照化合物（如F-SS-NH2、F-C6-NHAc等）在50μM時(shí)幾乎無(wú)細(xì)胞毒性。這表明F-C6-NH2的細(xì)胞毒性主要來(lái)源于其在溶酶體內(nèi)的自組裝過(guò)程。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot分析和免疫熒光確認(rèn)了成熟貓眼蛋白酶B（CatB）從溶酶體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活了NLRP3炎癥體，導(dǎo)致Caspase-1的剪切和GSDMD的裂解。這些結(jié)果表明，F-C6-NH2能夠通過(guò)破壞溶酶體膜，誘導(dǎo)GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，并釋放促炎細(xì)胞因子（如IL-1β和IL-18），從而激活免疫反應(yīng)。
NP-NH-D5的設(shè)計(jì)與制備：一種腫瘤特異性焦亡誘導(dǎo)劑
為了提高F-C6-NH2對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一種腫瘤靶向納米顆粒NP-NH-D5。NP-NH-D5通過(guò)共組裝F-C6-NH2和F-SS-NH-GALGLP-D5制備而成，后者含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)可被MMP-2剪切的肽段。這種設(shè)計(jì)使得NP-NH-D5能夠響應(yīng)細(xì)胞外的MMP-2和細(xì)胞內(nèi)的還原劑（如GSH和GILT），從而實(shí)現(xiàn)從負(fù)電荷納米顆粒到正電荷納米纖維的轉(zhuǎn)變。
實(shí)驗(yàn)中，NP-NH-D5在生理?xiàng)l件下表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，其粒徑約為60nm，表面電位為-4.39±1.52mV。當(dāng)暴露于MMP-2時(shí)，NP-NH-D5的粒徑減小至約55nm，表面電位增加至+25.58±1.40mV。進(jìn)一步的高分辨率質(zhì)譜（HPLC）和圓二色光譜分析確認(rèn)了MMP-2對(duì)F-SS-NH-GALGLP-D5的剪切作用，以及隨后在GSH或GILT作用下二硫鍵的還原反應(yīng)。最終，NP-NH-D5在細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)化為納米纖維，誘導(dǎo)溶酶體膜破裂和細(xì)胞焦亡。
NP-NH-D5選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的GSDMD介導(dǎo)的焦亡
NP-NH-D5在多種腫瘤細(xì)胞（如4T1、HeLa和A549）中表現(xiàn)出良好的細(xì)胞攝取能力，但在MMP-2缺陷的正常細(xì)胞（如GES-1）中則無(wú)明顯攝取。這表明NP-NH-D5能夠通過(guò)MMP-2介導(dǎo)的剪切作用特異性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC分析確認(rèn)了NP-NH-D5在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程，檢測(cè)到了F-C6-NH2和NH-GAL等代謝產(chǎn)物。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NP-NH-D5能夠顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其IC50值在不同腫瘤細(xì)胞系中有所不同，但均低于正常細(xì)胞系。此外，NP-NH-D5處理的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出典型的焦亡特征，如細(xì)胞腫脹、膜泡形成和GSDMD的裂解。Western blot分析進(jìn)一步確認(rèn)了Caspase-1的激活和GSDMD的裂解，表明NP-NH-D5能夠通過(guò)激活NLRP3炎癥體和GSDMD介導(dǎo)的焦亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。
圖 3 | NP-NH-D5體外及細(xì)胞培養(yǎng)中的表征
NP-NH-D5在體內(nèi)誘導(dǎo)焦亡以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫
為了評(píng)估NP-NH-D5在體內(nèi)抗腫瘤免疫治療中的效果，研究團(tuán)隊(duì)在原位4T1乳腺腫瘤模型中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NP-NH-D5在腫瘤組織中具有良好的富集能力，其熒光信號(hào)在注射后8小時(shí)達(dá)到峰值，且顯著高于對(duì)照組。治療結(jié)果顯示，NP-NH-D5能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少肺轉(zhuǎn)移，并延長(zhǎng)小鼠的生存期。組織學(xué)分析進(jìn)一步確認(rèn)了NP-NH-D5處理的腫瘤組織中存在大量納米纖維和溶酶體損傷，表明NP-NH-D5在體內(nèi)能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。
此外，NP-NH-D5處理的腫瘤組織中促炎細(xì)胞因子（如IL-1β和IL-18）的水平顯著升高，這有助于激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的成熟和T細(xì)胞的浸潤(rùn)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，NP-NH-D5能夠顯著增加腫瘤組織中CD4+和CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例。這些結(jié)果表明，NP-NH-D5不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡，還能通過(guò)激活免疫系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的有效抑制。
圖 4 | NP-NH-D5在原位4T1腫瘤小鼠模型中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)
圖 5 | NP-NH-D5聯(lián)合抗PD-L1有效清除4T1晚期肺轉(zhuǎn)移瘤
圖 6 | NP-NH-D5聯(lián)合抗PD-L1抑制原位Pan02胰腺腫瘤
小結(jié)
本研究開(kāi)發(fā)的NP-NH-D5納米顆粒為癌癥免疫治療提供了一種全新的策略。通過(guò)在腫瘤細(xì)胞溶酶體中特異性自組裝成納米纖維，NP-NH-D5能夠高效破壞溶酶體膜，誘導(dǎo)GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，并激活強(qiáng)烈的免疫原性細(xì)胞死亡反應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NP-NH-D5在抑制腫瘤生長(zhǎng)、防止轉(zhuǎn)移和延長(zhǎng)生存期方面的顯著效果。此外，NP-NH-D5與PD-L1抗體聯(lián)合使用時(shí)，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)免疫治療的效果，為臨床應(yīng)用提供了廣闊前景。未來(lái)，NP-NH-D5有望與其他化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用，克服耐藥性問(wèn)題，提高癌癥治療的整體效果。
參考文獻(xiàn)：
Zhang, J., Hu, Y., Wen, X. et al. Tandem-controlled lysosomal assembly of nanofibres induces pyroptosis for cancer immunotherapy. Nat. Nanotechnol. (2025).
https://doi.org/10.1038/s41565-025-01857-9
